Lasermessverfahren für die zeitaufgelöste Quantifizierung von Konzentrationsprofilen in hydrogel matrices

Schwendt, Tilman; Poprawe, Reinhart (Thesis advisor)

Aachen / Publikationsserver der RWTH Aachen University (2010) [Doktorarbeit]

Seite(n): IX, 150 S. : Ill., graph. Darst.

Kurzfassung

Enzyme eignen sich durch ihre hochspezifische katalytische Wirksamkeit für die industrielle Synthese von Feinchemikalien. Um sie in industriellen Prozessen, in denen Edukte und Produkte in organischen Lösungsmitteln geführt werden, einsetzbar zu machen, werden sie in wässrigen Hydrogelen immobilisiert. Sie behalten auch dann ihre katalytische Aktivität, wenn die Hydrogele in Form kleiner Kugeln in einer organischen Umgebungslösung suspendiert werden. Dieses neuartige Reaktionskonzept stellt einen erfolgversprechenden Ansatz für die industrielle Produktion hydrophober Feinchemikalien dar. Für die rationale Auslegung von Enzym Immobilisaten muss das komplexe Wechselspiel aus Diffusion in der Hydrogelkugel, Stofftransport über die Phasengrenze und der enzymatischen Reaktion detailliert untersucht werden. Die Entwicklung eines solch komplexen Modells verlangt die Bereitstellung aussagekräftiger und präziser Messdaten. Die Datengüte der klassischen Herangehensweise einer Probennahme aus der organischen Umgebungslösung ist für ein mechanistisch korrektes Prozessverständnis nicht ausreichend. Einen neuen Ansatz für Entwicklung von Methoden zur Detektion ortsaufgelöster Zeitverläufe von Konzentrationsgradienten auf mikroskopischer Skala in Hydrogelen bietet die Laserscanning Mikroskopie. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wird eine neue Methode zum optischen pH-Monitoring unter Verwendung pH-sensitiver Indikatorfarbstoffe vorgestellt. Dabei wird die Fluoreszenzlebensdauer als Funktion des pH Wertes bestimmt. Zu diesem Zweck werden zunächst die Kalibrierkurven zweier Indikatorfarbstoffe aufgezeichnet. Um in einer Kalibrierung die Korrelation zwischen pH-Wert und Fluoreszenzlebensdauer zu bestimmen, wird der Abfall der Fluoreszenzintensität nach einem anregenden Laserpuls zeitaufgelöst protokolliert. Ein konfokales Laserscanning Mikroskop mit integriertem Modul zum zeitaufgelösten Einzelphotonenzählen registriert Fluoreszenzabklingkurven mit einer zeitlichen Auflösung von 815 fs. Die protonierte und deprotonierte Form der Indikatorfarbstoffe besitzen unterschiedliche Lebenszeiten. An definierten pH-Werten setzt sich der aufgezeichnete Abfall der Lebensdauern aus beiden Spezies zusammen, wobei deren jeweiliger Anteil am Signal mit dem pH-Wert variiert. Eine Fitprozedur mit biexponentiell abklingender Fitfunktion liefert die Lebensdauern und deren Anteil am Signal. Zur Auswahl eines Indikatorsystems werden die Kalibrierkurven hinsichtlich pH-Bereich, Dynamikbereich und Messunsicherheit evaluiert. Nach der Auswahl von Resorufin als Indikatorfarbstoff wird die Eindiffusion von Propionsäure in Kalzium-Alginat Hydrogelbeads optisch bestimmt. Die zeitliche Änderung des pH-Wertes wird in der Mitte der Hydrogelkugeln mit einer zeitlichen Auflösung von 1 s untersucht. Die experimentellen Verlaufskurven werden mit den Vorhersagen der konkurrierenden Modellhypothesen nach Fickscher und Nernst-Planckscher Diffusion verglichen. Die konfokale Fluoreszenzlebenszeitspektroskopie mit mikroskopischer Auflösung wird somit erstmals zur Quantifizierung dynamischer pH-Änderungen in makroskopischen Partikeln eingesetzt. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wird mit der Multiphotonen Mikroskopie eine vielversprechende Methode zur orts- und zeitaufgelösten Detektion von Konzentrationsgradienten chemischer Komponenten, z.B. von Edukten und Produkten enzymatisch katalysierter Reaktionen in Hydrogelkugeln, aufgezeigt. Im Gegensatz zu gängigen Ansätzen vereinfacht die Methode durch eine verbesserte Orts- und Zeitauflösung bei der Datenakquisition die Identifizierung einer Vielzahl kinetischer Parameter wie Diffusions- und Transportkoeffizienten, sowie Gleichgewichtskonstanten und Umsatzraten in Hydrogelbeads. Zunächst werden die Phänomene Diffusion und Stofftransport mit gekoppelter Diffusion über die Phasengrenzfläche separat im Kugelmittelpunkt untersucht. In einem letzten Schritt wird das reaktive Gesamtsystem bestehend Diffusion Stofftransport und enzymkatalysierten Reaktion durch Messung von Konzentrationsgradienten entlang des Radius spektroskopisch charakterisiert. Die vorgestellte Messtechnik ermöglicht eine nachfolgende mechanistische Modellidentifikation, was mit einem verbesserten Verständnis der Reaktionskinetik einhergeht und die Auslegung und Entwicklung biotechnologischer Prozesse unterstützt. Es konnte eine exzellente örtliche (25 µm) und zeitliche (5 s) Auflösung durch eine multiphotonenbasierte Messmethode erreicht werden.

Identifikationsnummern

  • URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-34422
  • REPORT NUMBER: RWTH-CONV-125166